Artykuły

(opracowanie na podstawie: Peydayesh, Boschi, Donat, Mezzenga, Advanced Materials, 2024)

Streszczenie

Poniżej przedstawiono kompletny, laboratoryjny protokół otrzymywania aerożeli amyloidowych (AF) z izolatu białek serwatkowych (WPI), ich kluczową charakterystykę strukturalną oraz sprawdzoną procedurę badań adsorpcyjnych względem złota. Aerożele wytwarzane z 2% (m/m) dyspersji AF, usieciowane układem BTCA/SHP i liofilizowane, osiągają ultraniską gęstość (~33 mg·cm⁻³) i porowatość ok. 97%, zachowując stabilność mechaniczną i w wodzie. W układach wielometalowych wykazują wysoką selektywność i pojemność względem Au(III) (do ~167–190 mg·g⁻¹ w zakresie 1000 ppm), szybkie kinetyki (77% usunięcia w 5 min) oraz dobrze odtwarzalne parametry izoterm. Mechanizm wiązania obejmuje przyciąganie elektrostatyczne anionu [AuCl₄]⁻ do dodatnio naładowanej powierzchni AF (pH<5), chelatację na resztach aminokwasów i redukcję do Au⁰, czemu towarzyszy powstawanie płatków złota o orientacji (111).

Białka serwatkowe

Amyloidowe nanowłókna białkowe powstają, gdy natywne białka o strukturze globularnej ulegną częściowemu rozwinięciu i agregacji w uporządkowane włókienka o strukturze β-harmonijki. Białka serwatkowe – szczególnie β-laktoglobulina (BLG) – mają dobrze udokumentowaną zdolność do tworzenia takich amyloidowych fibryli w kontrolowanych warunkach. Poniżej podsumowano kluczowe warunki i właściwości procesu fibrylacji BLG/whey:

Warunki fizykochemiczne: Konieczne jest odbieganie od punktu izoelektrycznego białka oraz dostarczenie energii (ciepła) do jego denaturacji. Dla β- laktoglobuliny typowe warunki to silnie kwaśne pH (≤3) oraz podwyższona temperatura (≥75°C). W praktyce często stosuje się pH ~2,0 i temp. ~80°C. W takich warunkach BLG ulega częściowemu rozwinięciu i samorzutnie agreguje w długie, cienkie włókienka (średnica <10 nm, długość nawet powyżej 1–5 μm). Istotny jest również czas: formowanie dojrzałych fibryli zajmuje od kilku do kilkudziesięciu godzin. Przykładowo, ogrzewanie 2% roztworu WPI (głównie BLG) w pH 2,0 przez 20 godzin w 80°C daje interweniujące, długie nanowłókna amyloidowe o długości sięgającej kilku mikrometrów. Przy wyższych temperaturach (90– 120°C) możliwe jest skrócenie czasu potrzebnego do tworzenia fibryli, ale uzyskane włókna są wtedy zazwyczaj krótsze i bardziej giętkie (“worm-like”), w przeciwieństwie do dłuższych półsztywnych fibryli otrzymywanych przy łagodniejszym ogrzewaniu. Z kolei blisko punktu izoelektrycznego (~pH 5) β-LG zamiast fibryli tworzyłaby raczej amorficzne agregaty lub wytrącała się – stąd konieczność pracy w warunkach skrajnego pH.

Mechanizm powstawania: Podczas długotrwałego ogrzewania w kwaśnym pH następuje częściowa hydroliza białek serwatki na mniejsze fragmenty (2–8 kDa), co jest kluczowe dla dalszej samoorganizacji. Zdenaturowane łańcuchy BLG ulegają rozpadowi na peptydy, z których część pełni rolę jąder nukleacji (inicjują powstawanie fibryli), a pozostałe stopniowo dołączają się w uporządkowany sposób, wydłużając włókno. Powstają najpierw protofilamenty, które następnie reorganizują się w stabilne, dojrzałe fibryle o strukturze amyloidowej (bogatej w układy β-beta). Proces ten jest stosunkowo powolny – standardowe 20 h ogrzewania to bariera dla produkcji przemysłowej. Dlatego badacze testują przyspieszenie fibrylacji: np. mieszanie (stirring) roztworu podczas inkubacji w 80°C znacząco skraca czas potrzebny na uzyskanie długich włókien (o ok. 6 godzin, z 20h do ~14h) bez pogorszenia ich jakości. Mieszanie zapobiega lokalnym różnicom stężenia i ułatwia łączenie monomerów do rosnących fibryli, co przyspiesza cały proces.

Rola poszczególnych frakcji białkowych: Choć serwatka zawiera kilka białek, to β- laktoglobulina odgrywa dominującą rolę w tworzeniu amyloidu. Badania wykazały, że w mieszaninie białek serwatkowych praktycznie tylko BLG wbudowuje się we włókienka amyloidowe przy pH 2 i 80°C. Inne obecne białka (α-laktoalbumina, BSA, immunoglobuliny) albo pozostają w roztworze, albo ulegają niespecyficznej degradacji podczas ogrzewania kwasowego, nie tworząc długich fibryli. Dlatego WPI i WPC dają zbliżone wyniki fibrylacji– mimo że WPC ma niższą czystość, zawarta w nim BLG również utworzy włókna; różnicą może być wydajność (WPC dostarcza mniej BLG per gram proszku) i ewentualnie obecność laktozy wpływająca na przebieg reakcji. W praktyce większość prac naukowych stosuje WPI lub nawet oczyszczoną β-laktoglobulinę jako substrat do otrzymywania nanowłókien amyloidowych. Wspomniana wcześniej hydroliza enzymatyczna (WPH) może zmienić kinetykę: umiarkowana hydroliza może zwiększyć liczbę jąder i przyspieszyć nukleację (dając więcej krótkich „starterów” fibryli), lecz nadmierna hydroliza niszczy struktury potrzebne do zbudowania długich włókien. Dlatego do kontrolowanego otrzymywania nanowłókien zaleca się białko niezhydrolizowane.

Przykładowe parametry laboratoryjne: typowy protokół fibrylacji białka serwatki to: stężenie białka 1–5% (w/v), pH ustalone na 2,0 (np. kwasem solnym), temperatura inkubacji 80°C, czas 10–24 godzin. Warunki te można modyfikować – np. pH 2–3, temperatura w zakresie 75–90°C, czas krótszy przy wyższej temperaturze. Dodatek soli wpływa na morfologię włókien: w roztworach o niskiej sile jonowej powstają długie, półsztywne fibryle, podczas gdy obecność soli (np. NaCl) sprzyja tworzeniu bardziej giętkich, krótszych włókien przypominających „robaki”. Po zakończonej inkubacji roztwór fibryli jest zazwyczaj przezroczysty i lepki (fibrille są nanometryczne – nie rozpraszają mocno światła). Struktury amyloidowe potwierdza się np. barwnikiem tioflawiną T (wzrost fluorescencji) czy obrazując pod mikroskopem elektronowym, gdzie widać sieć długich, nitkowatych agregatów.

Fotografia 1. Serwatka

Opis procesu wytwórczego

1. Cel i zakres

Celem jest uzyskanie monolitycznych aerożeli AF z WPI w warunkach skalowalnych oraz opis ich kluczowych cech i wydajności adsorpcyjnej wobec złota, z jednoznacznymi recepturami (skala 100 mL i 500 mL) oraz checklistą kontroli jakości i metodyką testów adsorpcyjnych.

2. Protokół wytwarzania

2.1. Materiały

• Prekursor białkowy: izolat białek serwatkowych (WPI).
• Odczynniki: HCl (1 M do nastaw pH; 37% do zapasów), BTCA (1,2,3,4- butanotetrakarboksylowy), SHP (sodium hypophosphite, katalizator), woda Milli-Q.
• Wyposażenie: mieszadło magnetyczne, łaźnia/termostat 90 °C, pH-metr, formy (np. aluminiowe ~3 mL), zamrażarka −20 °C, liofilizator, piec do wygrzewania 175 °C, krzyżowy analizator polaryzacyjny (opcjonalnie).

Fotografia 2. mieszadło magnetyczne
Źródło: GenoPlast Biochemicals, „Mieszadło magnetyczne MS6-Pro DLAB Scientific”, karta produktu, dostęp 31 sierpnia 2025, https://genoplast.com/produkt/mieszadlo-magnetycznems6- pro-dlab-scientific/?attribute_nazwa=Mieszad%C5%82o+magnetyczne+MS6- Pro+DLAB+Scientific.

2.2. Receptura (warianty skali)2.2. Receptura (warianty skali)

• Skala 500 mL (wg źródła): 10 g WPI + 490 mL wody → 2% (m/m).
• Skala 100 mL (proporcjonalnie): 2,0 g WPI + 98 mL wody.

Cross-linking — dawki stałe względem masy białka (AF):
BTCA = 0,20 × (masa AF); SHP = 2,00 × (masa BTCA).
Przykład: dla 10 g AF → BTCA 2,0 g; SHP 4,0 g.
Dla 2,0 g AF → BTCA 0,40 g; SHP 0,80 g.

2.3. Wytwarzanie nanowłókien amyloidowych (AF)

1. Rozpuść WPI w wodzie (2% m/m).
2. Ustaw pH = 2 (HCl 1 M), mieszaj do jednorodności.
3. Inkubuj w 90 °C przez 5 h (łagodne mieszanie).
4. Schłodź gwałtownie (kąpiel lodowa).
5. (Opcjonalnie) potwierdź tworzenie AF przez obserwację dwójłomności w świetle spolaryzowanym.

2.4. Formowanie i sieciowanie monolitu

1. Do dyspersji AF dodaj BTCA (1:0,2, m/m względem AF) i SHP (SHP:BTCA = 2:1, m/m), wymieszaj do pełnej homogenizacji.
2. Odlej do form (~3 mL/szt.), odstaw na 10–15 min w RT.
3. Zamrażaj w −20 °C (co najmniej 4 h lub do pełnego zesztywnienia).
4. Liofilizuj do stałej masy.
5. Utwardź (sieciowanie termiczne) w 175 °C przez 15 min.
6. Wystudź do RT; przechowuj w suchym, zamkniętym pojemniku.

Fotografia 3. Liofilizator
Źródło: Chemosynteza, „Food-Storage-3”, fotografia, maj 2020, dostęp 31 sierpnia 2025, https://chemosynteza.pl/wp-content/uploads/2020/05/Food-Storage-3.jpg.

Uwagi BHP i jakości:

– Utrzymuj pH=2 precyzyjnie; pH>2,5 wydłuża fibrylizację.
– BTCA/SHP zapewnia trwałość w wodzie i integralność monolitu; unikaj lotnych aldehydów (np. glutaraldehydu) przy zastosowaniach środowiskowych.
– Liofilizuj z powolnym frontem zamrażania, jeśli zależy Ci na drobniejszej, bardziej izotropowej porowatości; szybkie mrożenie i/lub gradient → pory kierunkowe.

3. Charakterystyka materiału (minimum raportowe)

3.1. Morfologia i struktura

• AFM/TEM/STEM: obecność długich, półsztywnych fibryli (średnice rzędu kilku– kilkunastu nm; długości do μm).
• SEM (przekrój monolitu): sieć porów otwartych, ściany z matrycy włóknistej; brak makropęknięć po liofilizacji.
• XRD (po adsorpcji Au i redukcji): sygnały fcc Au przy 2θ ≈ 38,2°, 44,4°, 64,6°, 77,6° (płaszczyzny (111), (200), (220), (311)); płytki o orientacji [111] w SAD.

3.2. Właściwości masowe

• Gęstość objętościowa: ~33,18 mg·cm⁻³.
• Porowatość całkowita: ~97%.
• Stabilność wodna: zachowana po BTCA/SHP; monolit nie ulega dezintegracji w roztworach wodnych i kwaśnych (w granicach testów opisanych w źródle).

3.3. Kontrola etapu AF

• Birefringencja (cross-polarizer): szybka weryfikacja powstania AF.
• (Opcj.) widma UV-Vis/ThT: jakościowe potwierdzenie statusu amyloidu (jeśli dostępne).

4. Zastosowania adsorpcyjne — metodyka i wyniki referencyjne

4.1. Batch test — procedura

• Roztwory modelowe: mieszanki metali (np. Au, Cu, Ni, Zn, Pb, Fe, Mn, Cr) o kontrolowanych stężeniach (10 i 1000 ppm) oraz serie czystego Au (1–100 000 ppm).
• Warunki kontaktu: ~100 mg monolitu / 20 mL roztworu, 24 h, RT, statycznie (lub delikatna rotacja).
• Analityka: AAS lub ICP-OES; obliczenia q i R:

4.2. Selektywność i pojemność (benchmarks z literatury źródłowej)

• Mieszanka metali (≈1000 ppm każdy):
  – Au: R ≈ 93,3%; q ≈ 166,7 mg·g⁻¹.
  – Inne metale: usuwanie śladowe (np. Cr ~19,4; Fe ~10,3 mg·g⁻¹; pozostałe 0–2,3 mg·g⁻¹).
• Czysty Au (1000 ppm): q ≈ 190 mg·g⁻¹; przy 1–100 000 ppm q rośnie do ~1887
  mg·g⁻¹ na wysokich stężeniach.
• Kinetyka (1000 ppm): ~77% usunięcia po 5 min, plateau ~30 min; dopasowanie do modelu pseudo-II rzędu (chemisorpcja).
• Wpływ pH (1000 ppm): maksimum przy pH kwaśnym; spadek wraz z pH, ale różnica między pH 2 i 12 ~15%(istotne komponenty chelatacji i oddziaływań nieelektrostatycznych).

4.3. Mechanizm wiązania i redukcji

• Przy pH<5 AF są dodatnio naładowane; anion [AuCl₄]⁻ adsorbuje elektrostatycznie.
• Reszty Trp/His/Tyr/Asp redukują Au³⁺ → Au⁰; wiązania Au–S (Cys) stabilizują nukleację.
• W wyższych stężeniach Au powstają mikro-/nanopłytki o symetrii 120° i dominującej orientacji (111).

Uwaga praktyczna: dla szybkich testów przesiewowych (screening) wystarczy 60–120 min kontaktu; dla izoterm i kinetyk utrzymuj stałe hydrodynamiki i precyzyjny bilans objętości/massy monolitu.

5. Najczęstsze problemy i rozwiązania

• Dezintegracja monolitu w wodzie: zwiększ stopień sieciowania (więcej BTCA w granicach 1:0,25) lub wydłuż wygrzewanie (ostrożnie, by nie spiec struktury).
• Niska pojemność: sprawdź pH (celuj w 2–3), świeżość roztworu chloroauranów i integralność monolitu (brak kruszenia).
• Zbyt wolna kinetyka: rozdrobnij monolit na cylindry/krążki w tej samej łącznej masie lub zastosuj łagodne mieszanie.

6. Bezpieczeństwo

• Praca przy pH 2 i 90 °C wymaga okularów, rękawic i fartucha; wszystkie czynności z kwasami prowadź w dygestorium.
• Utwardzanie w 175 °C: używaj pieca z dokładną kontrolą temperatury; studź formy przed manipulacją.

Podsumowanie

Przedstawiono kompletny i powtarzalny protokół wytwarzania aerożeli amyloidowych z izolatu białek serwatkowych: formowanie nanowłókien (2% m/m, pH 2, 90 °C, 5 h), homogenizacja z układem sieciującym BTCA/SHP, odlew do form, zamrażanie i liofilizacja, a następnie wygrzewanie 175 °C/15 min. Otrzymane monolity charakteryzują się ultraniską gęstością (~33 mg/cm³), porowatością ~97% oraz stabilnością w wodzie. Pakiet charakterystyki obejmuje SEM/AFM/TEM, FTIR (pasm cross-β), XRD po obciążeniu Au, pomiar gęstości i podstawową mechanikę. W badaniach adsorpcyjnych w układzie porcjowym (~100 mg/20 mL) aerożele wykazują wysoką selektywność i pojemność względem Au(III): ~166–190 mg/g przy 1000 ppm, szybkie kinetyki (≈77% usunięcia po 5 min; plateau ~30 min) z dopasowaniem do modelu pseudo II rzędu; wpływ pH jest umiarkowany, a maksimum przypada na warunki kwaśne. Mechanizm obejmuje elektrostatyczne wiązanie anionu [AuCl₄]⁻ do dodatnio naładowanych AF, chelatację przez reszty aminokwasów i redukcję do Au⁰, co sprzyja powstawaniu płytek o orientacji (111). Protokół, wraz z checklistą kontroli jakości, jest gotowy do wdrożenia i skalowania.

Bibliografia (podstawa opracowania)

Peydayesh, M., Boschi, E., Donat, F., & Mezzenga, R. (2024). Gold Recovery from E-Waste by Food-Waste Amyloid Aerogels. Advanced Materials, 36(19),
2310642. https://doi.org/10.1002/adma.202310642

Rathod, Gunvantsinh & Amamcharla, Jayendra. (2024). Milk Whey Protein Fibrils—Effect of Stirring and Heating Time. Foods. 13. 466. 10.3390/foods13030466.

Loveday, Simon & Anema, Skelte & Singh, Harjinder. (2016). β-Lactoglobulin nanofibrils: The long and the short of it. International Dairy Journal. 67. 10.1016/j.idairyj.2016.09.011.

Spis ilustracji

Fotografia 1. Serwatka ………………………………………………………………………………………………… 3
Fotografia 2. mieszadło magnetyczne ……………………………………………………………………………. 5
Fotografia 3. Liofilizator ……………………………………………………………………………………………… 7